Nếu bạn sắp gửi mẫu đến phòng thí nghiệm hoặc tình cờ chỉ quan tâm đến vi sinh, Công thức nồng độ DNA có thể sẽ tiện dụng. Thậm chí tốt hơn, nó cũng hoạt động cho RNA và chuỗi oligo!
Chúng tôi cũng khuyến khích bạn đọc tiếp nếu muốn thỏa mãn cơn khát kiến thức. Trong bài viết này, bạn sẽ tìm hiểu về định lượng DNA và RNA, trọng lượng phân tử trung bình của các nucleotide, cách tính nồng độ DNA từ A₂₆₀ và cách xử lý oligonucleotide.
Phân tích quang phổ axit nucleic – Định lượng DNA và RNA
Định lượng DNA và RNA thường được thực hiện trước bất kỳ thí nghiệm nào để xác định nồng độ và độ tinh khiết của mẫu. Nhiều phản ứng liên quan đến axit nucleic có các yêu cầu cụ thể với hai giá trị này, vì vậy việc xác định chúng là cần thiết để đạt được kết quả mong đợi. Lượng thuốc thử bổ sung cũng phụ thuộc vào nồng độ ban đầu của mẫu. Các phương pháp định lượng phổ biến nhất là:
- Phân tích quang phổ axit nucleic: đo độ hấp thụ UV của chất để cho biết nồng độ và có bất kỳ chất gây ô nhiễm nào không. Nó không yêu cầu bất kỳ thuốc thử bổ sung nào nhưng không phân biệt được DNA và RNA, có độ nhạy hạn chế ở nồng độ thấp.
- Gắn thẻ huỳnh quang UV: sử dụng thuốc nhuộm phát huỳnh quang khi liên kết với axit nucleic. Phương pháp này tốn nhiều thời gian hơn và yêu cầu một tập hợp các mẫu đã biết để so sánh, nhưng nhạy hơn.
- Điện di gel agarose: phức tạp hơn nhưng có thể cho biết liệu mẫu của bạn có nguyên vẹn hay không. Nó không dựa vào việc kiểm tra độ hấp thụ DNA mà sử dụng gel agarose chứa ethidium bromide và các mẫu nồng độ đã biết để so sánh. Sau đó, sử dụng đèn UV để chụp ảnh gel, bạn có thể so sánh cường độ huỳnh quang và ước tính nồng độ.
Công thức nồng độ DNA của Omni nhằm mục đích giúp bạn phân tích kết quả của phép phân tích quang phổ.
Cách tính nồng độ DNA từ A₂₆₀
May mắn thay, nếu bạn đang xử lý một mẫu tiêu chuẩn, việc thu thập dữ liệu từ phân tích quang phổ của axit nucleic có lẽ là phần thử thách nhất. Sau đó, tất cả những gì bạn cần làm là sử dụng công thức sau được rút ra từ Định luật Beer-Lambert:
C = (A₂₆₀ × CF × DF) / l
Trong đó:
- C: Nồng độ của axit nucleic trong mẫu.
- A₂₆₀: Độ hấp thụ tối đa theo chỉ số đọc quang phổ. Điều này thường xảy ra ở bước sóng 260 nm, nhưng có thể thay đổi tùy thuộc vào nucleotide.
- l: Độ dài, cụ thể hơn là chiều dài của cuvet được sử dụng. Giá trị tiêu chuẩn là 1 cm, nhưng thiết bị của bạn có thể có kích thước khác.
- DF: Hệ số pha loãng. Nó chỉ áp dụng khi mẫu được pha loãng. Ví dụ: nếu pha loãng 1 lít mẫu trong 50 lít H₂O thì hệ số pha loãng là 50.
- CF: Hệ số chuyển đổi, phụ thuộc vào loại mẫu:
- 33 μg/mL cho DNA sợi đơn (ssDNA);
- 50 μg/mL cho DNA sợi đôi (dsDNA);
- 40 μg/mL cho RNA.
Các đơn vị nồng độ phổ biến nhất là μg/mL, ng/mL và mg/mL. Sau khi tìm hiểu cách tính nồng độ DNA từ A₂₆₀, hãy làm tương tự cho các loại mẫu khác.
Cách tính nồng độ chuỗi oligonucleotide
Oligonucleotide là các chuỗi DNA hoặc RNA tổng hợp ngắn có một số ứng dụng trong vi sinh học. Vì chúng cũng có thể được sử dụng trong các quy trình như PCR, đôi khi sẽ hữu ích nếu có thể tính toán nồng độ của chúng. Giá trị này được tính từ phương trình:
C = (A₂₆₀ × MW × DF) / (ε × l)
Trong đó:
- ε: Hệ số tuyệt đối; và
- MW: Trọng lượng phân tử.
Đơn vị nồng độ tương tự như trường hợp trước. Như bạn có thể đã nhận thấy, hệ số chuyển đổi đã được thay thế bằng hệ số tuyệt đối/trọng lượng phân tử. Thật không may, vì các oligo ngắn và có thể được tạo thành từ các nucleotide khác nhau nên các ước tính không chính xác. Do đó, chúng phải được tính toán theo cách thủ công.
Trọng lượng phân tử trung bình của một nucleotide
Để tìm trọng lượng phân tử tổng của chuỗi oligo, bạn chỉ cần cộng lại trọng lượng nguyên tử của tất cả các nucleotide trong đó. Bạn có thể phải điều chỉnh giá trị tùy thuộc vào loại nucleotide:
- DNA không có 5′ monophosphate: Chuỗi oligo không có bất kỳ sửa đổi nào. Để tính đến việc loại bỏ HPO₂ và bổ sung hai hydro, hãy trừ đi 61,96 Da cho ssDNA hoặc 123,38 Da cho dsDNA.
- DNA có 5′ monophosphate: Để bao gồm 5′ monophosphate do các enzyme hạn chế để lại, hãy cộng thêm 17,04 Da cho ssDNA hoặc 34,08 Da cho dsDNA.
- RNA có 5′ triphosphate: Để tính đến 5′ triphosphate, hãy cộng thêm 159,0 Da.
Đơn vị sử dụng là Dalton, 1 Da ≈ 1 g/mol.
Bảng giá trị có thể sử dụng cho phép tính:
| Nucleotide | ssDNA [Da] | dsDNA [Da] | RNA [Da] |
|---|---|---|---|
| Adenine | 313.21 | 616.78 | 329.21 |
| Guanine | 329.21 | 617.88 | 345.21 |
| Cytosine | 289.18 | 617.88 | 305.18 |
| Thymine | 304.20 | 616.78 | N/A |
| Uracil | N/A | N/A | 306.20 |
Ví dụ: nếu kiểm tra chuỗi oligo ssDNA AGGTC chưa sửa đổi, trọng lượng phân tử của nó sẽ là: 313,21 + 2 × 329,21 + 304,2 + 289,18 – 61,96 = 1503,05 g/mol.
Cách tính hệ số tuyệt đối của chuỗi oligonucleotide DNA và RNA
Hệ số tuyệt đối của một vật liệu mô tả cường độ hấp thụ ánh sáng của nó. Mặc dù đây là phép cộng khá đơn giản nhưng đại lượng này hơi khó. Điều này là do tổng phụ thuộc không chỉ vào các nucleotide thành phần mà còn vào thứ tự của chúng. Vậy làm thế nào để tính hệ số tuyệt đối của chuỗi oligo? Sử dụng mô hình láng giềng gần nhất:
Trong đó:
- ε₂₆₀: Hệ số tuyệt đối của chuỗi oligo ở 260 nm;
Tổng hệ số tuyệt đối của tất cả các cặp nucleotide liền kề; và
Tổng hệ số tuyệt đối của từng nucleotide riêng lẻ, không bao gồm nucleotide đầu và cuối.
Tổng hệ số tuyệt đối của từng nucleotide riêng lẻ, không bao gồm nucleotide đầu và cuối.Các giá trị thích hợp có thể lấy từ các bảng dưới đây. Đơn vị sử dụng là M⁻¹cm⁻¹, trong đó M là nồng độ mol.
Giá trị láng giềng gần nhất:
| 5’/3′ position | Adenine | Guanine | Cytosine | Thymine | Uracil |
|---|---|---|---|---|---|
| Adenine | 27,400 | 25,000 | 21,200 | 22,800 | 24,600 |
| Guanine | 25,200 | 21,600 | 17,600 | 20,000 | 20,000 |
| Cytosine | 21,200 | 18,000 | 14,600 | 15,200 | 17,200 |
| Thymine | 23,400 | 19,000 | 16,200 | 16,800 | N/A |
| Uracil | 24,000 | 21,200 | 16,200 | N/A | 19,600 |
Ở đây vị trí 5’/3′ liên quan đến thực tế là mỗi đầu của phân tử DNA có một số. Carbon 5′ có một nhóm phosphate gắn vào nó, carbon 3′ có nhóm hydroxyl-carbon. DNA được đọc theo hướng từ 5′ đến 3′.
Các base riêng lẻ:
| Nucleotide | Extinction Coefficient (M⁻¹cm⁻¹) |
|---|---|
| Adenine | 15,400 |
| Guanine | 11,500 |
| Cytosine | 7,400 |
| Thymine | 8,700 |
| Uracil | 9,900 |
Điều này có vẻ phức tạp, vì vậy hãy tiếp tục ví dụ về chuỗi oligo ssDNA AGGTC. Nó bao gồm 4 cặp: AG, GG, GT và TC. Do đó, tổng của εláng giềng gần nhất là: 25.200 + 21.600 + 19.000 + 15.200 = 81.000 M⁻¹cm⁻¹
Các base riêng lẻ được xem xét là G, G và T. Do đó:
2 × 11.500 + 8.700 = 31.700 M⁻¹cm⁻¹
Điều này cho ra hệ số tuyệt đối: ε₂₆₀ = 81.000 – 31.700 = 49.300 M⁻¹cm⁻¹
Vì chúng ta đã tính trọng lượng phân tử (1503,05 g/mol), nếu giả sử độ hấp thụ DNA là 4.900, không pha loãng, và kích thước cuvet tiêu chuẩn, chúng ta có thể tính nồng độ. Nhập các giá trị này vào Công thức nồng độ DNA cho kết quả cuối cùng là 149,39 mg/mL.
Câu hỏi thường gặp:
Nồng độ DNA tốt là bao nhiêu?
Có thể từ 10 đến 300 ng/μL, nhưng không có giá trị cố định, bạn nên kiểm tra với phòng thí nghiệm của mình. Nồng độ DNA cần thiết sẽ phụ thuộc vào:
-
- Độ nhạy của máy giải trình tự;
- Kích thước và thể tích mẫu; và
- Loại mẫu. Ví dụ: sản phẩm PCR cần ít nồng độ hơn plasmid.
OD₂₆₀ là gì?
OD là mật độ quang học ở bước sóng 260 nm,đo sự giảm truyền ánh sáng do phân tán. Ánh sáng truyền qua một chất càng chậm thì OD của nó càng cao. Nó liên quan đến độ hấp thụ A₂₆₀ như sau: OD₂₆₀ = A₂₆₀ × thể tích [ml] / chiều dài [cm].
Làm thế nào để tính nồng độ DNA từ OD₂₆₀?
Bạn có thể tính nồng độ DNA bằng công thức: nồng độ [μg/mL] = OD₂₆₀ × hệ số chuyển đổi Hệ số chuyển đổi chuyển đổi mật độ quang học thành nồng độ và có giá trị cố định cho dsDNA, ssDNA và RNA.
Làm thế nào để tính năng suất DNA từ nồng độ?
Để tìm năng suất DNA từ nồng độ của nó, hãy sử dụng phương trình sau: Năng suất DNA [μg] = Nồng độ DNA [μg/mL] × tổng thể tích mẫu [mL]. Năng suất DNA cũng phụ thuộc vào chất lượng, độ tươi và loại mẫu (ví dụ: nước bọt hoặc máu).
Tỷ lệ 260/280 có ý nghĩa gì?
Đó là tỷ lệ độ hấp thụ của mẫu ở bước sóng 260 và 280 nm. Nó được sử dụng làm thước đo độ tinh khiết của mẫu axit nucleic. Đối với DNA tinh khiết, giá trị được chấp nhận là ~1,8, trong khi đối với RNA, thường là ~2,0.
Làm thế nào để tính tỷ lệ 260/280?
Để tìm tỷ lệ 260/280, hãy làm như sau:
- Đo độ hấp thụ của mẫu ở bước sóng 260 nm (A₂₆₀).
- Đo độ hấp thụ của mẫu ở bước sóng 280 nm (A₂₈₀).
- Chia A₂₆₀ cho A₂₈₀ để thu được tỷ lệ.
Tại sao 260 nm được sử dụng cho DNA?
Axit nucleic hấp thụ ánh sáng UV ở bước sóng cụ thể. Đối với DNA và RNA, độ hấp thụ tối đa xảy ra ở 260 nm. Để so sánh, ở 280 nm, giá trị này giảm khoảng một nửa.
