Công thức này sẽ xác định nồng độ protein trong mẫu gốc hoặc mẫu pha loãng của bạn. Chỉ cần nhập dữ liệu từ máy quang phổ và chọn protein hoặc amino acid của bạn! Nhảy ngay vào phép tính hoặc tiếp tục đọc để:
- Học công thức tính nồng độ protein;
- Đi qua một ví dụ tính toán từng bước; và
- Nhận các giải thích cho tất cả các tham số trong công thức nồng độ protein, chẳng hạn như hệ số hấp thụ, chiều dài đường truyền và khối lượng phân tử.
Làm thế nào để tính nồng độ protein?
Công thức tính nồng độ protein từ độ hấp thụ được rút ra từ Định luật Beer-Lambert, (xem Công thức Định luật Beer Lambert của chúng tôi để biết thêm chi tiết), xác định nồng độ của các hóa chất hấp thụ ánh sáng. Sửa đổi Định luật Beer-Lambert, bạn nhận được công thức tính nồng độ protein:
A = ε × b × C
C = (A / (ε × b)) × m × n
Trong đó:
C— Nồng độ protein;A— Độ hấp thụ ở λmax;ε— Hệ số hấp thụ;b— Chiều dài đường truyền của cuvet;m— Khối lượng phân tử; vàn— Hệ số pha loãng.
Hiểu các thông số – độ hấp thụ, hệ số hấp thụ riêng, khối lượng phân tử, …
Để có thể tính toán nồng độ protein của một mẫu, chúng ta cần biết các giá trị của năm biến số:
- Độ hấp thụ;
- Hệ số hấp thụ;
- Chiều dài đường truyền;
- Khối lượng phân tử; và
- Hệ số pha loãng.
Độ hấp thụ
Độ hấp thụ hoặc mật độ quang (OD) có thể được đo bằng máy quang phổ. Giá trị cho chúng ta biết một mẫu hấp thụ bao nhiêu ánh sáng ở một bước sóng nhất định. Chúng ta muốn đo ở λmax nơi bước sóng của chất có sự hấp thụ mạnh. Đối với protein, λmax thường ở bước sóng 280 nm.
Hệ số hấp thụ
Hệ số hấp thụ cho bạn biết một chất hấp thụ hoặc phản xạ ánh sáng mạnh như thế nào ở một bước sóng cụ thể. Nó đặc trưng cho các chất khác nhau và thay đổi giữa các protein vì nó phụ thuộc vào cấu trúc nguyên tử và hóa học của chúng. Bạn có thể tìm thấy hệ số hấp thụ trong hướng dẫn protein hoặc amino acid của bạn.
Chiều dài đường truyền
Chiều dài đường truyền chỉ đơn giản là đường kính bên trong của cuvet mà bạn sử dụng. Thông thường, giá trị này bằng 1 cm.
Khối lượng phân tử
Nó là khối lượng nguyên tử của chất chia cho lượng của chất, được biểu thị bằng gam trên mol (g/mol). Hãy xem Công thức khối lượng phân tử của chúng tôi hoặc Công thức trọng lượng phân tử protein cụ thể của chúng tôi để xác định giá trị này và tìm hiểu thêm.
Hệ số pha loãng
Bạn cần xem xét tham số này nếu bạn không đo độ hấp thụ của một mẫu kho nhưng của một loại pha loãng. Ví dụ: nếu bạn có độ pha loãng 1:2, bạn sẽ nhập hệ số nhân 2 vào phương trình. Nếu bạn cần trợ giúp với việc pha loãng của mình, Công thức hệ số pha loãng của chúng tôi sẵn sàng giúp bạn!
Cách sử dụng máy tính nồng độ protein
Hãy xem xét một ví dụ để tìm hiểu cách Công thức nồng độ protein hoạt động:
- Chọn protein hoặc amino acid của bạn từ các tùy chọn trong menu thả xuống của Công thức. Việc chọn chất của bạn sẽ tự động đặt các giá trị cho hệ số hấp thụ và khối lượng phân tử của protein này. Công thức sẽ hiển thị các giá trị ngay bên dưới biến Protein.
Nếu bạn không thể tìm thấy chất của mình trong menu, bạn có thể chọn “Protein tùy chỉnh” để cung cấp cho Công thức các giá trị hệ số tuyệt chung và khối lượng phân tử cụ thể của protein của bạn. Bạn cũng có thể tìm thấy một bảng cho các hệ số hấp thụ và khối lượng phân tử của tất cả các protein có sẵn trong Công thức ở bảng này.
Giả sử chúng ta cần tìm ra nồng độ của một mẫu Immunoglobin G (IgG), có hệ số hấp thụ là 210.000 M⁻¹ cm⁻¹ và trọng lượng phân tử là 150.000 g/mol.
- Nhập bước sóng mà bạn đo được mức hấp thụ tối đa. Chúng tôi đo mẫu của mình ở mức 280 nm tiêu chuẩn, vì vậy chúng tôi nhập giá trị này vào Công thức.
- Nhập hệ số pha loãng. Nếu bạn sử dụng mẫu gốc, hãy nhập giá trị 1. Nếu bạn đang làm việc, ví dụ, với độ pha loãng 1:2, hãy nhập giá trị 2. Trong ví dụ của chúng tôi, chúng tôi sử dụng độ pha loãng 1:10, vì vậy chúng tôi nhập 10 vào trường Công thức theo thứ tự.
- Xác minh chiều dài đường truyền của cuvet. Công thức sử dụng giá trị mặc định là 1 cm, nhưng bạn có thể điều chỉnh nếu cần. Chúng tôi sẽ sử dụng một cuvet tiêu chuẩn có chiều dài đường truyền là 1 cm, vì vậy chúng tôi không cần làm gì ở đây.
- Để Công thức thực hiện phép tính! Sử dụng công thức nồng độ protein, Công thức sẽ ngay lập tức cho bạn kết quả:
C = (A280 nm / (210,000 M⁻¹ cm⁻¹ × 1 cm)) × 150,000 g/mol × 10 = 2000 mg/mL
Ví dụ về bảng hệ số hấp thụ riêng và khối lượng phân tử trong phổ quang
Xem bảng dưới đây để tìm các hệ số hấp thụ và khối lượng phân tử của tất cả các protein và amino acid có sẵn trong Công thức này. Các giá trị dựa trên nghiên cứu của BioSynthesis USA và nghiên cứu của von Hippel và Gill và có giá trị cho các phép đo ở độ hấp thụ 280 nm.
| Chất | khối lượng phân tử [g/mol] | hệ số hấp thụ [M⁻¹ cm⁻¹] |
|---|---|---|
| Aldose | 38.994 | 34.380 |
| APC – Allophycocyanin | 105.000 | 700.000 |
| ATP | 507,2 | 15.400 |
| BSA – Bovine Serum Albumin | 66.463 | 43.824 |
| Cysteine | 121,16 | 120 |
| IgG – Immunoglobin G | 150.000 | 210.000 |
| Insulin | 5734 | 6335 |
| Lysozyme | 14.000 | 37.901 |
| PE – Phycoerythrin | 240.000 | 1.960.000 |
| Phenylalanine | 165,19 | 200 |
| RNAse A | 13.700 | 9440 |
| Streptavidin | 55.000 | 176.000 |
| Tryptophan | 204,23 | 5500 |
| Tyrosine | 181,19 | 1490 |
Làm thế nào để đo nồng độ protein? Làm thế nào để tính nồng độ protein từ độ hấp thụ 280? Làm thế nào để tính nồng độ protein bằng μg mL? Thử nghiệm protein Bradford hoạt động như thế nào?
Các phương pháp tiêu chuẩn để đo nồng độ protein là đo độ hấp thụ UV bằng máy quang phổ (thường ở 280 nm) hoặc bằng cách phản ứng protein với thuốc nhuộm và/hoặc ion kim loại (ví dụ: thử nghiệm protein Bradford hoặc thử nghiệm BCA).
Để tính nồng độ protein C ở độ hấp thụ A = 280 nm, bạn cũng cần biết:
- Hệ số hấp thụ ε, ví dụ: đối với Immunoglobin G 210.000 M⁻¹ cm⁻¹;
- Khối lượng phân tử m, ví dụ: 150.000 g/mol;
- Chiều dài đường truyền của cuvet b, ví dụ: 1 cm; và
- Hệ số pha loãng n, ví dụ: 2.
Nhập các giá trị của bạn vào công thức tính nồng độ protein tính bằng mg/mL: C = (A / (ε × b)) × m × n C = (280 / (210.000 × 1)) × 150.000 × 2 C = 400 mg/mL
Để chuyển đổi nồng độ protein sang μg/mL, trước tiên bạn cần tính nồng độ protein bằng mg/mL và sau đó nhân kết quả với hệ số chuyển đổi 1000.
Nếu nồng độ protein của bạn là, ví dụ: 2000 mg/mL, bạn sẽ tính như sau: 2000 mg/mL × 1000 = 2.000.000 μg/mL = 2×10⁶ μg/mL
Phép đo nồng độ protein bằng xét nghiệm protein Bradford dùng phương pháp so màu dựa trên sự dịch chuyển độ hấp thụ cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue G-250 từ 465 đến 595 nm sau khi liên kết với các protein bị biến tính trong dung dịch.
Trong điều kiện axit, dạng đỏ của thuốc nhuộm được chuyển thành dạng xanh của nó, liên kết với protein đang được phân tích. Nếu không có protein để liên kết, thì dung dịch sẽ vẫn có màu nâu.
