Phản ứng chuỗi polymerase, hay PCR, là không gì khác ngoài một phép màu trong lĩnh vực công nghệ sinh học: hãy học cách tối ưu hóa kỹ thuật tuyệt vời này với máy tính nhiệt độ gắn mồi PCR của chúng tôi!
Tại đây, bạn sẽ học mọi thứ cần biết về PCR, các nguyên liệu cần thiết và bản thân quy trình. Chúng tôi sẽ trả lời các câu hỏi sau:
- Gắn mồi trong PCR là gì?
- Làm thế nào để tìm nhiệt độ gắn mồi để có kết quả tốt nhất?
- Làm thế nào để sử dụng máy tính nhiệt độ gắn mồi của chúng tôi? (đừng lo lắng, nó cực kỳ đơn giản!)
Hãy tiếp tục đọc để tìm hiểu thêm!
Giới thiệu về phản ứng chuỗi polymerase
Phản ứng chuỗi polymerase là một món quà bất ngờ từ sinh học. Đó là một kỹ thuật phòng thí nghiệm cho phép nhân bản một đoạn DNA nhỏ thành một lượng lớn các bản sao giống hệt nhau chỉ bằng cách cung cấp các công cụ phù hợp cho một enzyme và các khối xây dựng của DNA.
Quá trình này sử dụng cơ chế tự nhiên của sự sao chép DNA (đã tiến hóa qua hàng triệu và hàng tỷ năm) để có lợi cho nó: được kiểm soát và kiểm soát cẩn thận, điều này cho phép chúng ta nhắm mục tiêu một phân đoạn duy nhất cụ thể của mã di truyền và khuếch đại tín hiệu của nó một cách mạnh mẽ khi được phân tích.
Để hiểu cách PCR hoạt động, chúng ta cần khám phá DNA trước!
Tổng quan ngắn gọn về cấu trúc DNA
DNA – axit deoxyribonucleic – là hướng dẫn của sự sống trên Trái đất. Nó là một phân tử đơn giản chứa các hướng dẫn để xây dựng một sinh vật hoàn toàn hoạt động, từ vi khuẩn đến gấu mèo . Cấu trúc của nó là cấu trúc xoắn kép nổi tiếng, nơi hai sợi của một biopolyme liên kết và xoắn. Cấu trúc tương tự như xoắn đơn, một trong những axit nucleic cơ bản khác của sự sống, RNA (axit ribonucleic).
Bạn có thể hình dung một phân tử DNA như một thang xoắn. Mỗi bước được tạo thành từ một cặp phân tử được gọi là nucleotide, mỗi phân tử lần lượt bao gồm một nucleoside và một phosphate. Các bước được liên kết thông qua phốt phát cuối cùng. Còn nhiều hơn thế: mỗi nucleoside chứa một base nitơ và một đường năm carbon. Trước khi chuyển sang bước tiếp theo, hãy kiểm tra lại:
- DNA = chuỗi các nucleotide ghép cặp;
- Nucleotide = nucleoside + phosphate; và
- Nucleoside = base nitơ + đường năm carbon.
Quá trình ghép cặp của mỗi bước xảy ra ở kết nối giữa các base. Có bốn loại base, chúng ghép cặp theo các cặp sau:
- Adenine, A + T, Thymin; và
- Guanin, G + C, Cytosin.
Để được sử dụng, mỗi sợi DNA phải được “đọc” theo hướng chính xác. Nhìn vào cấu trúc của một nucleotide, các nhà sinh học đã quyết định tạo ra một ký hiệu để giúp hiểu rõ hướng chúng ta đang xem mọi lúc.
Việc đếm các nguyên tử carbon năm của đường cho phép xác định hai nguyên tử carbon (một trên mỗi nucleotide) kết nối các nhóm phosphate trong một sợi DNA. Hãy xem hình ảnh bên dưới:
Đây là sơ đồ hóa học của deoxyadenosin monophosphat, một trong bốn khối xây dựng của DNA. Chúng tôi đã đánh số các nguyên tử carbon trên vòng đường. Các nucleotide kết nối thông qua các nhóm phosphate, tương ứng với số carbon 3.
Hai carbon được đặt tên là 3′ và 5′, và do đó có thể xác định một hướng như 3’→5′, hoặc hướng ngược lại, 5’→3′.
Hình ảnh cho thấy một cặp nucleotide được kết nối (nucleotide dưới là guanin, trong khi nucleotide trên là một nhóm “R” chung). Kết nối thông qua phosphate xảy ra giữa các carbon 3′ và 5′ của hai đường, do đó tạo ra một “hướng”, được đánh dấu bằng màu đỏ trong sơ đồ.
Bây giờ bạn đã biết cấu trúc DNA như thế nào, hãy tìm hiểu cách nó sao chép.
Một lời giải thích thực sự ngắn gọn về quá trình sao chép DNA
Các tế bào trong cơ thể bạn và mọi tế bào trên hành tinh này (ngoại trừ một số ngoại lệ) liên tục tuân theo một chu kỳ sinh sản (chúng tôi có một công cụ để giúp bạn đếm chúng – máy tính thời gian nhân đôi tế bào). Quá trình liên quan đến việc sao chép mã di truyền (DNA) để tạo ra hai tế bào với một bộ gen đầy đủ, các hướng dẫn cần thiết để “xây dựng” một cá thể. Bản thân quá trình rất phức tạp, nói thẳng ra: chúng ta chỉ có thể giải thích ngắn gọn để giới thiệu các diễn viên của PCR.
Vào đầu quá trình sao chép, cấu trúc xoắn kép của DNA được “làm phẳng” và tách thành hai sợi đơn (ssDNA). Mỗi sợi để lộ các base của nó, cho phép một nhóm enzyme phức tạp tạo lại các sợi bổ sung.
Khi chúng ta nói về các hành động được thực hiện trên DNA như “làm phẳng” và “tách”, chúng ta đang nói về các phản ứng hóa học – đó là cách các tế bào hoạt động. Trong các phản ứng này, sự hiện diện của các enzyme là điều cơ bản. Biết tên của chúng không phải là điều cần thiết ở đây, nhưng hãy nhớ rằng hầu như mọi quá trình trong cơ thể bạn đều được hỗ trợ bởi chúng, hoạt động như chất xúc tác!
Điều đầu tiên xảy ra khi cấu trúc xoắn kép mở ra là quá trình sơ khai của sợi: các enzyme có một số hạn chế và không thể bắt đầu “sao chép” trực tiếp trên DNA. Một đoạn ngắn của RNA được gọi là mồi (bổ sung cho một trình tự cơ sở cụ thể) được gắn vào sợi mục tiêu. Từ đó, một enzyme gọi là DNA polymerase bắt đầu gắn các nucleotide mới, ghép chúng với các nucleotide của sợi và kết nối chúng qua cầu phosphate.
DNA polymerase hoạt động duy nhất theo hướng 5’→3′, và do đó nó chỉ có thể hoạt động trực tiếp trên một sợi của cấu trúc xoắn kép tách rời (nó bắt đầu quá trình sao chép từ điểm mở trên cả hai ssDNA). Bản sao trên sợi “sai” tiến hành thành từng mẻ nhỏ, được nối lại sau đó.
Nhiều quá trình khác xảy ra; chúng tôi chỉ mô tả những điều cơ bản. Quá trình sao chép tiếp tục, với cấu trúc xoắn kép của DNA dần mở ra cho đến khi nó tháo xoắn hoàn toàn và chúng ta thu được hai sợi con, mỗi sợi mang một nửa của phân tử mẹ.
PCR là gì?
PCR, phản ứng chuỗi polymerase, là kỹ thuật đơn giản đột phá nhất trong sinh học. Nó lấy một mẫu DNA ngắn và nhân bản nó theo cấp số nhân hàng triệu lần với sự trợ giúp của enzyme polymerase. Toàn bộ quá trình được điều khiển bởi một chu kỳ nhiệt, giúp thực hiện cực kỳ đơn giản và thuận tiện.
Nhà sinh hóa Kary Mullis đã nghĩ ra kỹ thuật PCR vào năm 1983, không phải trong phòng thí nghiệm hay trường đại học, mà là trong xe hơi trên đường đi nghỉ cuối tuần! Nhà sinh hóa kỳ lạ này đã tưởng tượng ra cơ chế sao chép này và thừa nhận đã dừng xe hai lần để ghi lại. Sau này, ông nhận được Giải Nobel Hóa học, và trong một dịp khác, ông gặp một con gấu mèo huỳnh quang biết nói. Nhưng đó là một câu chuyện khác.
Nguyên tắc của PCR là tái tạo quá trình sao chép DNA trong một lọ thủy tinh, cụ thể là trên đoạn mục tiêu, và cho phép quá trình này lặp lại nhiều lần. Từ một sợi duy nhất, bạn sẽ nhận được hai sợi con, từ hai sợi, bốn sợi, và cứ thế – giới hạn duy nhất được đặt bởi số lượng chất phản ứng có sẵn.
Quá trình này cho phép tạo ra các đoạn nhỏ không thể tìm thấy trong mã di truyền bằng cách tìm kiếm (thậm chí còn tệ hơn việc tìm kim trong đống rơm theo nghĩa đen) nhưng dễ dàng phát hiện sau khi khuếch đại theo cấp số nhân. Kỹ thuật này trở thành công cụ tốt nhất trong kho của mọi nhà khoa học làm việc với DNA khan hiếm: nhà khảo cổ học và cổ sinh vật học, nhà hóa học pháp y và nhà di truyền học. Mọi người đều được ăn bánh!
Bản thân PCR cũng được khuếch đại trong đại dịch coronavirus. Xét nghiệm chính xác nhất cho virus sử dụng kỹ thuật này. Sau khi bạn nhận được mẫu bông gòn, các kỹ thuật viên sẽ thêm mồi cụ thể cho mã di truyền của virus vào mẫu từ mũi của bạn. Nếu mồi khớp với gen của virus, quá trình khuếch đại bắt đầu và bạn có kết quả dương tính!
Các thành phần của PCR
PCR chỉ đòi hỏi một lượng “nguyên liệu” đáng ngạc nhiên nhỏ để thực hiện thành công. Hãy xem xét chúng.
- Đoạn mục tiêu, hoặc khuôn mẫu DNA, là phần cụ thể của mã di truyền sẽ trải qua quá trình khuếch đại.
- Các mồi DNA là các đoạn sợi đơn ngắn, thường được cung cấp trong hai loại tương ứng với mặt cụ thể của mỗi đầu mục tiêu (3′). Chúng chỉ có thể được tổng hợp khi trình tự di truyền của mục tiêu đã được biết.
- Enzyme polymerase, ngôi sao thực sự của quá trình. Nó cho phép khuếch đại bằng cách gắn các nucleotide mới vào các sợi mẹ. Hiện tại, các phòng thí nghiệm sử dụng một loại enzyme kháng nhiệt được gọi là Taq-polymerase.
- Các nucleotide cần thiết để tạo ra các bản sao. Chúng ở dạng deoxynucleotide triphosphate: hai nhóm phosphate “dư thừa” cung cấp năng lượng cho enzyme.
- Dung dịch đệm, môi trường nơi phản ứng xảy ra, được ổn định bởi các cation hai hóa trị như Mg2+.
Bây giờ chúng ta đã biết các thành phần, hãy chuyển đến quy trình – đây gần như là blog ẩm thực của một nhà sinh hóa!
Các bước của một chu kỳ PCR
Một chu kỳ nhiệt điều khiển PCR vì mỗi bước của nó (phản ứng hóa học) xảy ra ở các khoảng nhiệt độ rất nghiêm ngặt và riêng biệt. Có thể “kích hoạt” và “vô hiệu hóa” một bước bằng cách gia nhiệt hoặc làm nguội dung dịch nơi PCR đang diễn ra. Cơ chế này cho phép dễ dàng tự động hóa PCR trong các máy luân nhiệt.
Hãy xem chi tiết các bước của quá trình. Đầu tiên, đổ tất cả các nguyên liệu của bạn vào lọ. Bật máy luân nhiệt và để cho sinh học diễn ra!
- Biến tính. Trong bước này, nhiệt độ được nâng lên 94-98°C trong 20-30 giây. DNA mục tiêu tách thành hai sợi đơn khi các liên kết hydro giữa các base bị phá vỡ.
- Gắn mồi. Nhiệt độ được hạ xuống 50-65°C trong 20-40 giây. Các mồi gắn vào DNA mục tiêu trong giai đoạn này. Nhiệt độ của bước này rất quan trọng vì chỉ giá trị chính xác cho phép khớp hoàn hảo giữa mục tiêu và mồi – nếu không, chúng có thể ghép vào trình tự sai.
- Giai đoạn tổng hợp. Trong bước này, nhiệt độ được nâng lên 75-80°C, chính xác tại nhiệt độ tối ưu cho enzyme polymerase. Các nucleotide tự do được ghép với DNA mục tiêu, tạo ra hiệu quả một bản sao mới của đoạn gốc. Thời gian phụ thuộc vào độ dài của mục tiêu và enzyme được chọn.
Khi chúng ta đạt đến bước thứ ba, chúng ta bắt đầu lại với bước đầu tiên, do đó mở tất cả các đoạn mục tiêu được sao chép và có bốn ssDNA.
Khi nucleotide bị cạn kiệt, quá trình tự kết thúc. Theo số chu kỳ n được thực hiện “đầy đủ” (khi vẫn còn dư thừa base), có thể ước tính số đoạn N_DNA hiện có trong dung dịch. Công thức đơn giản đến mức trông sai:
N_DNA = 2^n
Vì vậy, nếu máy luân nhiệt thực hiện 10 chu kỳ, chúng ta kết thúc với 2^10 = 1,024 đoạn. Nhưng thêm 10 chu kỳ nữa (tổng cộng là 20) sẽ đưa số bản sao lên 2^20 = 1,048,576. Sự gia tăng thuần túy theo cấp số nhân, và vì nó bắt đầu từ một đoạn duy nhất, đó là một phản ứng dây chuyền thuần túy: học toán học đằng sau sinh học tại máy tính tăng trưởng cấp số nhân của chúng tôi!
Trong phần tiếp theo, chúng ta sẽ tìm hiểu cách xác định nhiệt độ gắn mồi trong PCR!
Nhiệt độ gắn mồi PCR là gì?
Nhiệt độ gắn mồi PCR là nhiệt độ của bước gắn mồi trong một chu kỳ nhiệt PCR. Giá trị của nó phụ thuộc vào nhiệt độ biến tính của cả mồi (kém ổn định hơn) và DNA mục tiêu.
Công thức thực nghiệm được sử dụng để xác định nhiệt độ gắn mồi tối ưu Ta* là:
Ta* = 0,3 x Tmp + 0,7 x Tmt – 14,9
Ở đây, Tmp là nhiệt độ biến tính (nóng chảy) của mồi kém ổn định nhất, và Tmt là nhiệt độ nóng chảy của mục tiêu.
Giá trị của chúng được xác định bằng các công thức khác, phụ thuộc vào thành phần và chiều dài của các sợi.
Hằng số 14,9 chỉ hoạt động khi bạn sử dụng nhiệt độ đo bằng độ Celsius. Đối với Fahrenheit, hằng số là 58,82, và đối với Kelvin, nó là 288,05: học cách chuyển đổi giữa các đơn vị đó bằng công cụ chuyển đổi nhiệt độ của chúng tôi.
Nhiệt độ gắn mồi kiểm soát cách các đoạn mồi kết hợp với các sợi mục tiêu. Nhiệt độ cao hơn có nghĩa là các liên kết giữa mồi và mục tiêu có thể không hình thành. Mặt khác, nhiệt độ thấp hơn cho phép liên kết trên trình tự base không chính xác.
Sau khi mồi và mục tiêu liên kết, enzyme polymerase tham gia vào, kết nối với đầu 3′ của mồi, và chờ nhiệt độ tối ưu cho quá trình tổng hợp.
Cách sử dụng máy tính nhiệt độ gắn mồi PCR
Chúng tôi sẽ nhanh chóng hướng dẫn bạn cách sử dụng máy tính nhiệt độ gắn mồi tối ưu của chúng tôi!
Hãy lấy một ví dụ. Chúng tôi đã chọn một sợi DNA từ gen mèo từ một kho lưu trữ trực tuyến. Sợi mục tiêu chúng tôi tìm kiếm là ∼2 kb, trong đó kb có nghĩa là kilobase, hoặc một nghìn nucleotide. Chúng tôi KHÔNG định viết nó ở đây!
Chúng tôi thiết lập các điều kiện thí nghiệm phù hợp (nồng độ ion và các chất phản ứng khác), và sử dụng công thức Wallace, chúng tôi thu được nhiệt độ nóng chảy Tmt = 88,6°C.
Bây giờ chúng tôi cần thiết kế các mồi. Đó là một nghệ thuật tự thân: ví dụ này, chúng tôi chỉ đơn giản sao chép 30 base cuối cùng ở cả hai đầu của DNA mục tiêu. Sử dụng công thức của Allawi và SantaLucia, chúng tôi xác định nhiệt độ nóng chảy cho các mồi. Dưới đây là hai sợi:
GGGGGATCTTTCTCTATAGGAAACAATTAAvới Tmp1 = 65,5°C; vàCACAAGCACACATGCGCACATTTGCACACAvới Tmp2 = 74,6°C.
Từ đây, bạn có thể giúp chúng tôi! Lấy nhiệt độ nóng chảy của mục tiêu và nhiệt độ nóng chảy của mồi kém ổn định hơn, và nhập chúng vào máy tính. Kết quả đến từ công thức:
Ta* = 0,3 × Tmp + 0,7 × Tmt – 14,9 = 66,77°C
Nhiệt độ này cao hơn một chút so với khoảng được đề xuất cho quá trình gắn mồi (60–65°C), nhưng chúng tôi không thiết kế một thí nghiệm thực sự, vì vậy nó vẫn ổn!
Bây giờ thì sao?
Bạn đã học mọi thứ từ cấu trúc DNA (nhưng chúng tôi đoán bạn đã biết điều gì đó!) đến cách tìm nhiệt độ gắn mồi trong một chu kỳ PCR. Chúng tôi hy vọng máy tính nhiệt độ gắn mồi của chúng tôi đã giúp bạn thiết kế thí nghiệm hoặc chỉ đơn giản thỏa mãn sự tò mò của bạn.
Hãy thử các máy tính sinh học khác như máy tính gắn kết hoặc máy tính lai ba tính trạng!
Câu hỏi thường gặp
Gắn mồi trong PCR là gì?
Bước gắn mồi trong PCR là giai đoạn thứ hai của một chu kỳ nhiệt trong đó DNA mục tiêu có các đầu của nó được ghép với hai mồi 5′ → 3′, từ đó enzyme polymerase có thể bắt đầu quá trình sao chép.
Nhiệt độ gắn mồi trong PCR là gì?
Bước gắn mồi phải diễn ra ở một nhiệt độ cụ thể để đảm bảo sự khớp hợp tốt giữa hai sợi. Nhiệt độ gắn mồi nằm trong khoảng từ 55 đến 60 độ Celsius.
Làm thế nào để tìm nhiệt độ gắn mồi trong PCR?
Để tính nhiệt độ gắn mồi trong một chu kỳ PCR, bạn cần nhiệt độ nóng chảy của mồi kém ổn định nhất Tmp và nhiệt độ nóng chảy của DNA mục tiêu Tmt, cả hai đều tính bằng độ Celsius.
Sau đó, áp dụng công thức:
Ta = 0,3 × Tmp + 0,7 × Tmt – 14,9
Hoặc truy cập máy tính nhiệt độ gắn mồi tại omnicalculator.com!
Ảnh hưởng của nhiệt độ gắn mồi PCR sai là gì?
Nhiệt độ thấp hơn mức tối ưu có thể gây ra sự khớp không chính xác giữa mồi và mục tiêu. Lỗi này xảy ra do lợi thế năng lượng của liên kết tạo điều kiện thuận lợi cho phản ứng. Mặt khác, nhiệt độ cao cho các phân tử đủ năng lượng để không liên kết. Đó là lý do tại sao điều quan trọng là phải biết cách tìm nhiệt độ gắn mồi trong PCR.
